Sob a liderança de Duke, o grupo G.I. Joe combatia a vilania com os melhores guerrilheiros de diversas parte do mundo. Entre os principais personagens que aparecem no desenho estão: Lady Jane, Bazooka, Dusty, Scarlett, Flint, Gung-Ho, Espírito, Hawk, Wild Bill, Law, Beach Head, Falcão, Roadblock, Leatherneck, Cutter, Snake Eyes, Footloose, Sparks, Quick Kick, Deep Six, Mutt, Sargento Slaughter, Heavy Metal, Jinx, Mercenário, Short Fuze, Zap. Também aparecem: Ace, Airborne, Airtight, Alpine, Barbeque, Big Lob, Blowtorch, Breaker, Chukles, Clutch, Dial Tone, Doc, Flash, Frostbite, Grunt, Iceberg, Lifeline, Lift Ticket, Recondo, Red Dog, Rip Cord, Rock n´Roll, Slipstream, Stalker, Steeler, Taurus, Thunder, Stoolboth, Torpedo, Tripwire e Tunnel Rat.

Liderados pelo Comandante Cobra a organização Cobra era formada por combatentes bem treinados com o intuito de promover o terrorismo. Entre os integrantes da força inimiga tínhamos: Destro, Baronesa, Serpentor, Dr. Mindbender, Major Bludd, Ripper, Tomax, Copperhead, Buzzer, Scrap Iron, Caveira, Monkeywrench, Storm Shadow, Pythona, Xamot, Zandar, Firefly, Wild Wiesel, Golobulus, Zarana, Nemesis Enforcer, Thrasher.